Caracterización de las glicoproteínas de una cepa de virus respiratorio sincicial aislada en Cali (página 2)

RESULTADOS

Caracterización de las glicoproteínas
virales. Los patrones electroforéticos obtenidos de las
proteínas extraídas de células
infectadas con las cepas de VRS que se emplearon en este trabajo,
permitieron el estudio de las glicoproteínas de la
envoltura de cada una de ellas. Para este enfoque se efectuaron
análisis electroforéticos en
condiciones no reductoras y en geles reductores en presencia de
2-Mercaptoetanol.

En condiciones no reductoras se determinó la
presencia de dos bandas de glicoproteína marcadas con
[3H]-Glucosamina cuyas Mr calculadas fueron 95 y 70 kd,
respectivamente. Las dos bandas fueron semejantes en las dos
cepas de VRS estudiadas (Figura 1A). El patrón
electroforético observado para ambas cepas cuando se
emplearon condiciones reductoras, reveló la presencia de
cuatro bandas comigrantes cuyas masas moleculares relativas
calculadas fueron 95, 70, 43.8 y 25 kd (Figura 1B). En los geles
analizados bajo condiciones reductoras fue notable la
disminución en la intensidad de la banda de 70 kd. De esta
manera, la suma de los pesos moleculares de las dos nuevas
glicoproteínas que aparecen en los geles sometidos a
condiciones reductoras, es aproximadamente 70 kd. Esto puso en
evidencia que la banda de 70 kd es un dímero cuyas
subunidades poseen Mr de 43.8 y 25 kd,
respectivamente.

Figura 1. Patrón
electroforético de la incorporación de
3H-Glucosamina en las glicoproteínas de dos cepas del
virus
respiratorio sincincial. A. Patrón obtenido en condiciones
no reductoras. B. Patrón obtenido por el tratamiento con
2-Mercaptoetanol que promueve condiciones reductoras. CALI: cepa
obtenida de un episodio en un niño menor de un año
con infección aguda producida por el VRS. LONG: cepa
prototipo ATCC-VR-26. del VRS. HEP-2: control de
células Hep-2 de carcinoma laríngeo humano no
infectadas con el VRS. Los números que indican cada una de
las bandas proteicas, corresponden a las masas moleculares
relativas dadas en kilodaltons (kd)

Caracterización de la reactividad
antigénica por inmunoblot. Al emplear la serie de sueros
tanto de pacientes en distintas fases de la infección como
sueros hiperinmunes obtenidos a partir de conejos, se
determinó la reactividad antigénica de las diversas
fracciones de proteínas del virión. En el Cuadro 1
se presenta un resumen de los resultados obtenidos en los
distintos experimentos de
inmunoblot que se llevaron a cabo a partir de proteínas
extraídas de la cepa Long y de la cepa Cali-0015 en los
que se emplearon condiciones reductoras y no reductoras. Se
determinó que la reactividad de los sueros de pacientes a
proteínas virales en fase aguda y convaleciente fue
distinta. Además, se definió que algunos
epítopes son más reactivos en fase aguda que en la
fase convaleciente. Por otro lado, los patrones de inmunoblot
obtenidos a partir de sueros hiperinmunes para las dos cepas
ensayadas, fueron idénticos en ambas condiciones. Con
anticuerpos monoclonales se observó reactividad e identidad
inmunogénica sólo con el anticuerpo monoclonal
92-11c que se unió con la banda de 70 kd bajo condiciones
no reductoras tanto para la cepa Long como para la cepa Cali-0015
(Cuadro 1).

Cuadro 1

Inmunorreactividad de las
Proteínas de las Cepas Cali y

Long del VRS a Diferentes Tipos de
Sueros

Fragmentación proteolítica de la
glicoproteína 70 kd. La Figura 2 muestra la
localización más probable de los sitios de
hidrólisis con la proteasa V8 en la glicoproteína
70 kd de la envoltura de los viriones de la cepa Long y la cepa
Cali-0015.

Figura 2. Localización de los sitios de
hidrólisis para la proteasa V8 en la glicoproteína
de 70 kd del virus respiratorio sincicial obtenidos por el
tratamiento de bandas purificadas provenientes de las cepas Long
y Cali del VRS. NH2, extremo amino de la gp70; COOH, extremo
carboxilo de la gp70. Glu, ácido glutámico.
Ø,
localización del sitio de corte de la proteasa V8. Los
números indican las masas moleculares relativas
correspondientes a cada péptido.

La digestión de la banda de 70 kd purificada
previamente a partir de geles de poliacrilamida no reductores,
permitió visualizar 11 fragmentos peptídicos de V8
con masas moleculares relativas aproximadas de 16.9 a 40 kd. De
esta colección de péptidos, fueron más
intensas los de 34.3, 22.2, 20 y 16.9. Dos de ellos están
glicosilados (34.2 y 22.2 kd). La suma de estos tres
péptidos es equivalente a la masa total de la
glicoproteína de 70 kd (70±0.5).

El tratamiento de la misma banda de 70 kd con tripsina,
no mostró ningún patrón de
fragmentación tanto en los geles teñidos con
nitrato de plata como en los sometidos a
fluorografía.

DISCUSION

Desde el aislamiento del VRS como agente causal de
cuadros de infección respiratoria aguda, el estudio
bioquímico del mismo se ha visto dificultado por los
problemas
presentes en el aislamiento y purificación de las
preparaciones obtenidas por la infección in
vitro.

Actualmente se informan protocolos en los
que la eficiencia de
purificación es de 18%20 y de 33%11
de la infectividad inicial. Se ha determinado que 90% del virus
producido no es liberado de la célula.
Este hecho plantea un problema para lograr preparaciones
relativamente no contaminadas por proteínas del
citoesqueleto celular. En este trabajo las eficiencias obtenidas
fueron de aproximadamente 50% con lo que se logró una
ganancia con respecto a los otros protocolos que se utilizaban
antes.

Tal vez uno de los aspectos importantes de este trabajo
en lo que refiere a la purificación del virus, es su
relativa pureza de proteínas celulares sin pérdida
de la infectividad. Estos resultados permiten establecer que los
procedimientos
de purificación para este tipo de virus deben tener en
cuenta la obtención de concentraciones de proteínas
muy bajas pero con un alto grado de infectividad.

Los hallazgos previos con referencia a la
caracterización electroforética de las distintas
proteínas del virión son contradictorios. Los
estudios realizados en la cepa Long, permitieron caracterizar
siete polipéptidos estructurales con Mr que varían
entre 10 y 200 kd12,21,22. Los cálculos de las
masas moleculares relativas efectuados en este trabajo para las
distintas bandas en electroforesis en gel de poliacrilamida en
condiciones no reductoras, coinciden con los previamente
obtenidos por Trudel et al.23

Otra conclusión importante del presente trabajo
es que las movilidades de los polipéptidos obtenidos de la
cepa Cali-0015 son similares a las de la cepa Long. En este
sentido, los intentos para efectuar una caracterización en
serotipos de acuerdo con patrones diferenciales, han mostrado que
ese enfoque no es muy resolutivo. Solamente algunas
pequeñas variaciones en el tamaño de la
glicoproteína de 70 kd, han podido ser resueltas en geles
largos; sin embargo, esto es difícil y poco
práctico24.

Aunque Wrunner y Pringle25 identificaron en
virus parcialmente purificados, la presencia de dos bandas de
glicoproteína con pesos moleculares de 98 y 42 kd, en este
trabajo se observaron tres bandas notorias de 70, 40 y 30 kd; sin
embargo, los resultados obtenidos están en concordancia
con los de Levine12 quien identificó tres
glicoproteínas principales a partir de viriones
parcialmente purificados y marcados con 3H-Glucosamina (VP1=79
kd; VP2=56 kd; VP3=25 kd). Además, en este trabajo se
obtuvieron evidencias de
una banda extra de 98 kd, observada en los geles no
desnaturalizantes analizados22.

El estudio electroforético de las
glicoproteínas virales efectuado en condiciones
reductoras, reveló la presencia de dos nuevos
polipéptidos que aparentemente se derivan de la
despolimerización de la banda 70 kd. Así se puede
decir que la glicoproteína de 70 kd estaría
conformada por polipéptidos con Mr de 43.8 y 21 kd unidos
mediante puentes disulfuro. Los estudios de Gruber y
Levine26 y Fernie y Gerin27, determinaron
que la glicoproteína F está compuesta por dos
subunidades denominadas F1 (45 kd) y F2 (25 kd). Tales
proteínas juegan un papel importante en la fusión de
membranas y en la formación de sincicios in vitro. Estas
dos subunidades también son características de los
miembros de la familia
Paramyxoviridae28.

El análisis de las proteínas virales
mediante su reactividad evaluada por inmunoblot, permitió
confirmar el origen viral de las glicoproteínas 98 y 70 kd
a partir del polipéptido precursor de 150 kd,
además de otras dos proteínas cuyas masas
moleculares son 30 y 40 kd, respectivamente. Estas últimas
no se habían determinado en geles de poliacrilamida
sometidos a tinción con nitrato de plata.

La proteína de 30 kd podría corresponder a
la proteína de la matriz (M) la
p27 ó p2829, que no es una glicoproteína y se
asocia sólo de manera parcial con la envoltura del
virión. De otra parte el polipéptido de 40 kd
correspondería a la proteína constitutiva de la
nucleocápside viral cuya masa molecular Trudel et
al.23 calcularon previamente en 40 ó 41
kd.

El suero humano agudo ensayado en este trabajo
exhibió una reactividad diferencial cuando se
comparó con el de la fase convaleciente. La presencia de
la banda de 40 kd en el suero recuperado de la fase aguda de la
infección, en ambas cepas, puso de manifiesto un comportamiento
antigénico diferencial para este péptido. Si se
supone que los anticuerpos presentes en este suero son de origen
materno, este hallazgo coincide con los resultados obtenidos por
Ward et al.30, quienes encontraron que las madres de
niños
que no se enfermaban durante las epidemias de VRS en los primeros
seis meses de edad, tenían niveles altos de anticuerpos
contra la proteína 40 kd, en contraste con las madres de
bebés que presentaban infecciones repetidas durante los
primeros seis meses de vida y quienes no mostraban reactividad
contra la P40.

Las glicoproteínas gp98 y gp70 presentaron sitios
antigénicamente reactivos para el suero humano y el suero
hiperinmune de conejo. Sin embargo, la gp98 no fue reconocida por
los sueros anticonejo VRS-Cali y anti VRS-Long. Este resultado se
podría interpretar como un efecto de la respuesta del
huésped al virus o de este huésped a la
glicoproteína. En el primer caso, si se considera que la
glicoproteína está glicosilada en más de 50%
de su masa total31 y que el patrón de
glicosilación depende de la célula
huésped, es posible postular que este antígeno estimuló la producción de anticuerpos en el conejo, en
su mayoría hacia la fracción glicosilada. Tal
interpretación podría explicar
algunas reacciones cruzadas que se observaron en el caso de
células no infectadas. Con el fin de probar esta hipótesis se pudo bloquear la
inespecificidad de adsorción del suero en la monocapa
contra glicoproteínas de las células y de la gp98
del virus, hecho que confirma la hipótesis
propuesta.

Las principales subclases de IgG comprometidas en la
inmunidad de moléculas altamente glicosiladas como la gp98
son de las subclases IgG2 e IgG4 cuya concentración es
baja en bebés menores de un año. Cuando se
examinó el patrón de sueros convalecientes, se pudo
explicar la ausencia o baja reactividad a la gp98 como el
resultado más bien de una respuesta de tipo IgM-anti-gp98,
que no sería demostrable por el sistema utilizado
de proteína A radioiodinada que se empleó en este
trabajo.

El análisis de la inmunogenicidad de las
proteínas que se separaron en condiciones reductoras
indicó que la subunidad F1 de la banda 70 kd es reactiva
en sueros humanos y de conejo. Es de interés
observar que el efecto del 2-Mercaptoetanol suprimió la
fuerte reactividad a la banda de 70 kd y apareció una
nueva banda reactiva de 43.2 kd que correspondería a la F1
(Cuadro 1); no se observó reactividad de los sueros contra
la subunidad de 25 kd posiblemente porque el efecto reductor en
los puentes disulfuro alteró la conformación del
potencial epítope. Sin embargo, en la
literatura9 se presenta una fuerte evidencia que los
epítopes reactivos de F se localizan en la F1 y que
tendrían un efecto neutralizante y desencadenador de la
formación de sincicios.

Como se reconoce la importancia de las
glicoproteínas del virus en el establecimiento de los
mecanismos de inmunopatogénesis y con base en el papel
fundamental que cumple la gp70, se iniciaron estudios para
establecer diferencias a nivel de la estructura de
las dos gp70 de las cepas que se analizaron. La
caracterización proteolítica de las gp70 de ambos
viriones con la proteasa V8 permitió por primera vez
enfocar las semejanzas antigénicas de las posibles
secuencias de aminoácidos y su importancia en la
conformación molecular de los epítopes de esta
glicoproteína viral. Los ensayos con
esta proteasa pusieron de manifiesto la existencia por lo menos
de dos residuos de Glu en la gp70. Los péptidos de 11 a 7
kd conservaron los determinantes de neutralización con el
anticuerpo monoclonal y con los sueros policlonales de conejo. La
posible localización de los epítopes en la gp70 de
la cepa Long sería en la región amino terminal de
F1. Esta evidencia abre la posibilidad de emplear la F1 como un
marcador de tipo polimórfico porque se podrían
ensayar los péptidos V8 terminales contra sueros de
pacientes y así valorar la constancia de la respuesta a
nivel poblacional.

SUMMARY: An isolate of respiratory syncytial
virus obtained from a two months old child with acute respiratory
infection included into an epidemiological study performed in
Cali (1986-1990), was used to characterize by molecular and
immunological methods the viral glicoproteins that play important
role in the mechanism of immunopathogenesis of respiratory
infection caused by this kind of virus. The characterization of
in vitro radiolabeled proteins with 3H-Glucosamine by
electrophoresis, revealed glicoproteins of 98, 70, and 30 kd as
structural components of viral envelope. Gp70 is
immunopathogenically important because it exerts an IgE mediated
protection passively transmitted by the mother. It was possible
to characterize two protease V8 sites on the gp70 that were
similar in Cali and Long viral strains. By immunoblot analysis,
the F1 subunit of gp70 showed an important role in neutralizing
immunoresponse in acute phase of human sera and hyperimmune sera
from rabbits. Taken together results obtained showed the
antigenic and structural similarities between the Cali and Long
strains.

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Beatriz Parra, M.Sc.2, Isabella Borrero,
M.Sc.3, Felipe García, Ph.D.4
1. Trabajo financiado con
fondos del proyecto
ARI-BOSTID-NSF.USA y la Vicerrectoría de Investigaciones,
Universidad del
Valle, Cali.
2. Profesional Especializada, Departamento de Microbiología, Escuela de
Medicina,
Facultad de Salud, Universidad del
Valle, Cali.
3. Profesora Titular, Departamento de Microbiología,
Escuela de Medicina, Facultad de Salud, Universidad del Valle,
Cali.
4. Profesor
Titular, Departamento de Ciencias
Fisiológicas y Laboratorio de
Biología
Molecular y Patogénesis, Escuela de Medicina, Facultad de
Salud, Universidad del Valle, Cali.